近日，南京农业大学资源与环境科学学院曹慧团队在《Journal of Hazardous Materials》上发表了题为“Discovery of a polyester polyurethane-degrading bacterium from a coastal mudflat and identification of its degrading enzyme”的研究论文(DOI: 10.1016/j.jhazmat.2024.136659)。该研究从沿海滩涂中分离出一种高效降解聚氨酯（PU）的细菌Aeromicrobium sp. LTX1，并通过紫外线诱变获得其突变株MLTX1。研究发现，MLTX1在4天内可降解86%的PU泡沫，远超现有报道的微生物降解效率。此外，研究还通过多组学方法鉴定出一种新型角质酶PurH，该酶在大肠杆菌中表达后能有效降解PU泡沫。这一发现为PU塑料的生物降解和回收提供了新的科学依据和潜在生物催化资源。
研究背景
聚氨酯（PU）是一种由多元醇和异氰酸酯合成的聚合物，因其优异的隔热和机械性能，广泛应用于汽车、建筑、医疗和纺织品等领域。根据欧洲塑料协会（2023年）的数据，PU是全球第六大最常用的塑料，占全球塑料产量的5.3%，约4亿吨。然而，PU的广泛使用导致大量固体废弃物的产生，且由于缺乏有效的回收机制，大多数PU废弃物最终被填埋或焚烧。填埋场中的PU废弃物自然分解缓慢，可能需数千年，并影响土壤pH值；焚烧则会产生有毒气体和重金属，造成生态毒性。近年来，PU的生物降解作为一种环保的回收方法迅速发展，能够减少填埋空间并生成水、二氧化碳和生物质。已有研究表明，某些微生物如铜绿假单胞菌A12和枯草芽孢杆菌MZA-75等能够有效降解PU，但固体PU的降解效率仍较低，主要因其复杂的化学结构和成分。尽管已有大量研究，PU生物降解的机制仍不明确，尤其是针对其软链段和硬链段的降解。酯酶在软链段降解中起关键作用，而硬链段的降解则更为困难，尽管某些酶如木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶显示出降解氨基甲酸酯键的潜力。因此，发现新的高效酶或通过酶工程提高其催化效率，以实现PU的完全降解和回收，是当前研究的重点。本研究旨在分离和表征一种高效降解PU的细菌LTX1，并通过多组学方法鉴定关键降解酶。
图文导读
图1. 菌株LTX1和MLTX1的分离与鉴定及其降解PU塑料的能力评估
研究团队从沿海泥滩的样品中分离出11株细菌，通过PU泡沫降解实验筛选出降解效率最高的菌株LTX1，并利用紫外线诱变技术获得了降解效率更高的突变株MLTX1。MLTX1菌株在平板上产生的透明区直径大于LTX1菌株，表明其具有更强的PU降解能力。通过16S rRNA基因序列分析，两株菌株与Aeromicrobium sp. HA高度相似，结合形态学和遗传特征，最终将其鉴定为气微菌属。
在降解实验中，MLTX1菌株表现出显著的PU泡沫降解能力。经过2天的培养，MLTX1处理的聚酯-PU泡沫开始崩解，4天后完全降解为粉末，而LTX1菌株则需要12天才能达到相同的降解水平。定量分析显示，LTX1菌株在14天内对PU泡沫的降解效率达到86.52%，而MLTX1菌株仅需4天即可达到相同的降解效果。此外，MLTX1菌株对多种PU塑料的降解效率均显著高于LTX1菌株，但在硬质PU和聚醚基PU的降解上表现相对较弱。
图2. LTX1和MLTX1处理4天后PU泡沫的降解评估。
通过扫描电子显微镜和傅里叶变换红外光谱分析了菌株LTX1和MLTX1对聚氨酯泡沫的降解效果。结果显示，LTX1处理的PU泡沫表面变得粗糙且不均匀，出现裂缝和空隙，而MLTX1处理的PU泡沫仅出现微小碎片。FTIR光谱显示，菌株分泌的酶水解了PU泡沫中的酯键和氨基甲酸酯键。热重分析表明，MLTX1处理的PU泡沫在更高温度下开始分解，并表现出更高的降解速率。以上结果说明MLTX1在降解PU泡沫方面表现出更高的效率。
图3. LTX1、MLTX1及模式菌株Aeromicrobium sp. HA的基因组分析
通过对LTX1菌株及其突变菌株MLTX1的基因组进行测序和比较基因组学分析，发现它们的基因组相对于基准菌株Aeromicrobium sp. HA显著增大。在LTX1和MLTX1基因组中鉴定出的PurH基因，与具有PU降解活性的Thermomonospora curvata DSM43183水解酶具有63.24%的同源性。尽管核苷酸序列相似性适中，但PurH蛋白展现出明显的结构一致性，揭示了α/β水解酶折叠的存在，表明其在PU降解中可能发挥重要作用。
图4. LTX1和 MLTX1的差异表达基因分析
通过转录组学分析发现LTX1和MLTX1菌株之间存在显著差异基因表达，特别是MLTX1中PurH基因显著上调。GO和KEGG分析揭示了与细胞成分、代谢调节及RNA生物合成相关的上调途径，可能解释了PurH高表达的原因。KEGG通路中，ABC转运蛋白、氧化磷酸化和群体感应显著变化，说明MLTX1可能通过感知环境并分泌大量PurH酶到细胞外间隙来增强PU降解。验证实验证实了主要差异表达基因的可重复性，特别是PurH在MLTX1中的高表达，强调了其在提高降解效率中的关键作用。
图5. PurH 酶的表达、纯化和验证
通过克隆PurH基因至pET29a（+）载体并在T7启动子控制下表达，获得了PurH水解酶。该酶在SDS-PAGE上呈现单一条带，并在平板上展现出清晰的透明降解区域，表明其具有降解PU的能力。进一步实验显示，PurH酶能完全水解PU泡沫，导致显著重量损失。这些结果证实了从LTX1和MLTX1菌株中克隆的PurH基因在PU生物降解过程中的关键作用。
主要结论
本文成功分离出高效PU降解菌株Aeromicrobium sp. LTX1及其突变株MLTX1，两者在降解测试中分别使PU泡沫重量损失高达86%。通过SEM、FTIR和TGA分析证实，这些菌株能分泌特异性酶催化PU泡沫酯键和氨基甲酸酯键的水解。特别的是，PurH酶在降解中起关键作用，且在MLTX1中转录表达显著增高。本研究不仅深化了对PU塑料生物降解分子机制的理解，还为新型生物降解技术开发和PU材料可持续利用提供了科学基础和潜在生物催化资源。
